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多肽合成常见的问题(二)

多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物,是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽,同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10~100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。


常见问题

1.为什么含有Cys,Met,或Trp的多肽难合成?

答:含有Cys,Met,或Trp的多肽合成非常困难,与此同时获得高纯度的产品也非常的困?#36873;?#20027;要是由于这些基团容易氧化,不稳定。尤其需要注意这些多肽的使用和储存,反?#32431;?#21551;盖子的?#24418;?#23613;量避免。


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2.为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

答:多肽合成与引子合成之间的差别比较大,很少有引子不可以合成,然而却有很多不能合成的多肽例如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这些氨基酸比邻或重复时,在合成过程中,多肽链不能完全舒展溶解,降低了合成的效率。在如重复Pro,Ser-Ser,重复Asp,4个连续Gly等情形之下,具有比较低的合成效率和产物的纯度。


3.多肽是如何纯化的?

答:反相柱(如C8,C18等),214nm通常被使用来进行多肽的纯化。含TFA的溶剂,pH2.0一般为缓冲体系。BufferA为含0.1%TFAinddH2O,BufferB为1%TFA/ACN/pH2.0。在进行纯化之前,先使用BufferA进行溶解,若溶解不理想,在使用BufferB溶解后,再使用BufferA进行稀释,如果多肽的疏水性很强,那么还必须将少量的FormicAcid或醋酸加入。使用HPLC对多肽粗产物进行分析,如果多肽的长度在15aa以下,通常会有主峰,主峰一般是全长产物。对于20aa以上的长肽,如果没有主峰,HPLC需搭配Mass来对分子量进行判定,来对哪个峰是所要合成的多肽进行确定。


4.多长的多肽为合适?

答:长度,电荷,亲疏水性等为多肽合成时必须要考虑的因素。合成粗品的纯度和产率会随着多肽长度的增加而降低,从而会增大不能合成的概率和纯化的难度。?#27604;?#26080;法使多肽功能区的序列发生改变,然而不得不将一些辅助氨基酸增加在功能区的的上下游,类似对多肽的溶解性和亲疏水性加以改善以便顺利合成多肽。若多肽偏短,合成亦有可能出现问题,合成的多肽在后处理过程中有一定的难度是主要的问题,少于5肽的多肽,通常需要具备疏水的氨基酸,不然会增加后处理难度,少于15个氨基酸残基的多肽,它的产率和得率通常均很满意。


5.如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?

答:(1)若Met,Phe,Trp,Leu,Val和比例很高的多很强的疏水性的氨基酸包含于多肽中,那么多肽在水性溶液中溶解很难或者基本不可能。这些氨基酸?#36824;?#26159;纯化还是合成,均会出现问题。


(2)通常而言,疏水性氨基酸所占的比例应当低于50%,不能连续5个aa为疏水性,带电荷的氨基酸的的比例达到20%。若在多肽的N或C短对极性氨基酸进?#24615;?#21152;,也能够使得溶解性得到改善。


2019-07-24 17:51:10 浏?#26469;问?09次
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