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DNA测序仪

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手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。

DNA测序仪
DNA测序仪原理

DNA测序仪原理

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动...[查看全部]

DNA测序仪原理

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。


原理

传统的聚丙烯酰胺平板电泳被淘汰,取而代之的是毛细管电泳,abi prism 310型基因分析仪就是采用毛细管电泳技术,此公司专利的四色荧光染料标记的ddntp得到应用,所以利用单引物pcr测序反应,相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链dna物混合为生成的pcr产物,使四种荧光染料的测序 pcr产物能够在一根毛细管内电泳,从而使泳道间迁移率差异的影响得以避免,使测序的精确度得到大大的提高,因为分子大小的差异,在毛细管电泳中有着不一样的迁移率,当其?#29992;?#32454;管读数窗口段经过的时候,激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器能够逐个检测荧光分子,利用光栅将激发的荧光分光,来对代表不同碱基信息的不同颜色的荧光加以区分,并且同步?#19978;?#20110;ccd摄影机上,不同荧光经过分析软件能够被转变为dna序列,从而使dna测序的目的达到。可以通过荧光吸收峰图、碱基排列顺序或者凝胶电泳图谱等多种?#38382;?#23558;分析结果输出。


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DNA测序仪是一台对dna片段的碱基顺序或大小进行测定和定量的仪器,其还可以自动数据收集、自动进样以及自动灌胶。genescan胶(pop 4)和dna测序胶(pop 6)等凝胶高分?#27891;?#21512;物由pe公司提供,这些凝胶颗粒有着均一?#30446;?#24452;,使配胶条件不相同对测序精度的影响得以避免。电泳附件、电脑、彩色打印机、毛细管电泳装置等为DNA测序仪的主要构成组件。资料收集,分析和仪

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DNA测序国内发展

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。


国内?#32431;?/span>

当今世界,如果要评?#30340;?#20010;地方会诞生传奇,那么必定是高科技领域,从前DNA测序还作为一个前沿技术令人高山仰止,如今却成为一个生命科学常规技术,迅速地得到普及,目前为止,能够和电脑芯片运算能力增强的速度相媲美的也就只有DNA测序成本下降的速度,DNA测序的发展除了在降?#32479;?#26412;方面得到了体现,还在高通量测序大幅度提高了工作效率方面得以表现,其铺平了DNA测序产业化的道路。


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在DNA测序商业化的?#39034;?#19979;,完成5个以上有重大经济价值的基因或蛋白的转化应用、约500个新的功能基因的发现,10000种微生物、100种动植物基因组测序等目标在我国《生物产业发展“十二五”规划?#20998;?#34987;提出。根据30-50万元为微生物进行“基因组完成图”测序的大?#36335;?#29992;而言,千亿元级别为DNA测序带来的市场容量,其还只是DNA测序商业应用市场的冰山一角。


在?#30340;冢珼NA测序有着高贵的出身,其将碱基序列这一基因密码破解,融合了IT技术与基因组学,将生物信息学这一新兴学科开创和发展了出来。传统的生物学技术被以生物信息学为代表的基因技术彻底颠覆了,对生命科学未来发展潮流起到引领作用,在医?#24179;?#24247;、环?#28526;?#25252;、新能源、新材料、现代农业等热门领域以它为代表的基因工程得到了广泛地应用。


用途

该仪器的应用相当地广泛,能够进行进行dna测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析,临床上不但能够进行常规dna测序,而?#19968;?#33021;够进行

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DNA测序仪操作步骤

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。


操作步骤

一、pcr测序反应

1、取0.2ml的pcr管,用记号?#26102;?#21495;,在颗粒冰中插上pcr管,将2μl 灭菌去离子水、1μlm13(-21)引物、1μl 待测dna的正向引物、1μl pgem-3zf (+) 双链dna、1μl 待测的质粒dna、1μl bigdye mix加入,轻矿物油或石蜡油不添加,将pcr管盖紧,用手指弹管混合均匀,稍稍离心。


2、在2400型或9600型pcr仪上放上pcr管进行扩增,在98℃下变性两分钟之后进行pcr循环,60℃4min、50℃ 5s以及96℃ 10s为pcr的循环?#38382;?#32463;历25个循环,在完成扩增以后将温度设置为4℃保温。


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二、使用醋酸钠/乙醇法对pcr产物进行纯化

1、离心混合物,往1.5ml ep管中转移入扩增产物。


2、将醋酸钠/乙醇混合液 25μl加入,充分振荡,放到冰上10分钟来使得dna沉淀。12000r/min在4℃条件下离心半个小时,仔细弃上清。


3、将50μl70%(v/v)的乙?#25216;?#20837;,进行2次洗涤?#31890;?2000r/min在4℃条件下离心5分钟,仔细弃上清以及管壁的液珠,再经过10到15分钟的真空?#31245;?#27785;淀。


三、电泳前处理测序pcr产物

1、在离心管中将12μl tsr加入,剧烈振荡,,使其充分溶解,沉淀dna,稍稍离心。


2、往盖体分离的0.2ml pcr管中转移入溶液,稍稍离心。


3、热变性(95℃ 2min)在pcr仪上进行,在冰中迅速降温,等待上机。


四、将彩色测序图谱分析或打印出来

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DNA测序方法

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。


测序方法

在分子生物学?#33455;?#20013;,目的基因的进一步?#33455;?#21644;?#33041;?#26159;以DNA的序列分析为基础的。Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法为用于测序的主要技术,Sanger测序法的应用非常的广泛。Sanger法是以核苷酸开始于某一固定的点,终止于某一个随机的特定的碱基处,并?#20197;?#27599;个碱基后面进行荧光标记,使得以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸产生,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而使得可见的DNA碱基序列被获取为依据。有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)包含于每个反应,让其扩增,并且有一种不同的限量的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)混入将其终止。因为?#30001;?#25152;需要的3‘-OH基团为ddNTP所或?#20445;?#20174;而在G、A、T或C处择性地终止延长的寡聚核苷酸。反应中相应的双脱氧决定了终止点。为了使反应得到一组长几个至千以上个,相差一个碱基一系列片断,可以调整每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓?#21462;?#23427;们的起始点相同,然而终止点却在不一样的核苷酸上,大小不同的片?#25991;?#22815;通过高分辨率变性凝胶电泳分离。凝胶处理后能够使用非同位素标记或者X-光胶片放射自显影来进行检测,这即是Sanger法测序的原理。


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现状和意义

有50余个?#33455;?#23567;组在威康信托基金会中,其是英国最大的生物医学?#25163;?#26426;构之一。双向障碍病、冠心病、克罗恩氏病、风湿性关节炎、高血压以及I型糖尿病和II型糖尿病等多疾病的基因的筛查这一项颇具野心的庞大计划和挑战由他们在过去的几年开展

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DNA测序仪发展历史和注意事项

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。


发展历史

70年代末,化学法和双脱氧手动测序,同位素标记法分别由WalterGilbert与FrederickSanger发明出来。


80年代中期,应用双脱氧终止法原理,自动测序仪出现了,同位素被荧光取代了,计算机图象识别。


90年代中期,测序仪得到了重大改进,凝胶电泳由集束化的毛细管电泳取代了。


2001年,人类基因组框架图被完成。


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注意事项

1.bigdye荧光标记终止底物循环测序?#32422;?#30418;为本实验使用的测序?#32422;?#30418;,通常650bp左右为可测dna长度,(98.5±0.5) %为本仪器dna测序精确度,如果仪器所需测定的长度高于650bp,不能辨读的碱基n<2%,那么就需要设计另外的引物。能够设?#21697;?#21521;引物对同一模板进行测序,相互印证以便确保更为准确地测序。能够人工核对n碱基,有时能够将其辨读出来,为了使测序的精确度提高,按照星号提示位置,能够对?#20040;?#24425;色图谱进行人工分析,进一步核对?#20040;?#30897;基。


2.对于测序用户,仅仅需要将好的dna样品和引物提供,一个测序pcr反应使用不一样的模板,也就需要不同的dna量,pcr测序只需要比较少的模板的量,通常双链dna需200~500ng,单链dna需50~100ng,pcr产物需30~90ng,dna的溶解zui好不要使用te缓冲液,而是使用去离子水或三蒸水。使用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl的引物比较好


3、abi prism 310基因分析仪为精密仪器,必须由专人负责操作、管理和维护。


4、5μl为实验测序pcr反应的总体积,并且没有添加矿物油进行覆盖,因此,pcr管盖的密封?#26434;?#20026;重要,不仅需要在完成?#32422;?#28155;加后将pcr管盖盖紧,而且zui好选用pe公司的pcr管。如果在结束pcr以后,pcr液体积低于4~4.5μl,那么表明该pcr反应可

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DNA测序意义

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。


意义

全球最大的基因组测序及?#33455;?#24212;用中心之一位于深圳的华大基因?#33455;?#38498;,华大基因承担了人类基因组计划1%的工作任务,之后又对国际HAPmap计划进行了参与与完成,并且将叫做“炎黄一号”di一个中国人也是di一个亚洲人的基因组测序完成了。


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DNA测序方法的飞速发展除了使人类的全基因组序列为我们所知晓,而?#19968;?#20351;得我们充分掌握了小麦、水稻、家蚕以及很多细菌。此时,科学家们的新目标也就变成了对一段序列所代表的生物学意义的探明。用于编码基因仅仅只有1.5%存在于核苷酸组成的庞大序列中,除此以外,扮演调控基因表达的角色有少许,其中功能未知的“垃圾DNA”占绝大部分,这一发现是科学家通过分析人类基因组序列获得的。由表面可知,人与人之间有着缤纷复杂的不同之处,然而,深入到DNA水平上,却仅仅存在0.1%基因编码序列上的不同。大多数时候,人与人之间在一条序列上的差异只有一个核苷酸,科学家将这种现象命名为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,简称SNPs)。


从前将致病相关基因从数万个人类基因中筛选出来犹如大海捞针。为了对这个基因究竟在?#26410;?#24819;方设法的定位,科学家需要对同一个家族的多位患者的标本进行获取。设计高通量药物,致病或?#26893;?#22522;因的鉴定、疾病易感人群的筛查甚至个性化医疗由于具备了如今快速测序技术和SNPs这个强有力的工具而不再是需要向往的事。


用途

该仪器的应用相当地广泛,能够进行进行dna测序、杂合子分析、单链构象多态

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